摘要：對南京微測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進行了評估。該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg，最低定量限為82μg/kg，線性范圍為100-5000μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%，同一個樣本的檢測3次的CV<14.75%，與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%，與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合用于對糧食谷物飼料中嘔吐毒素的進行快速定量測定。

　　關(guān)鍵詞：嘔吐毒素快速定量檢測;熒光定量免疫層析;嘔吐毒素;糧食谷物飼料

　　嘔吐毒素主體成分為DON(deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)，屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。另外，頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產(chǎn)生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強有力免疫抑制劑，所引起典型癥狀是采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素(DON)是其中最重要一種毒素，主要來自鐮刀菌屬(Fusarium)，尤其是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素(vomitoxin，VT)。

　　該毒素最早于1970年在日本香川縣的一次赤霉病大麥中毒的病毒中發(fā)現(xiàn)，1972年，由日本的Morooka等首次從赤霉病大麥中分離，Yoshizawa等闡明了這種新的真菌毒素的結(jié)構(gòu)，并將其命名為4-deoxynivalenol(DON)。1973年Vesonder等在美國從被鐮刀菌污染的玉米中分離出了同樣的化學物質(zhì)，因為該種物質(zhì)可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥狀，故命名為嘔吐毒素，并相繼發(fā)現(xiàn)可以在赤霉病大麥、被鐮刀菌污染的玉米中分離出該物質(zhì)。嘔吐毒素是食品中常見的真菌毒素，在自然界中廣泛存在，通常在歐洲及北美發(fā)現(xiàn)的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。由于它們具有很高的細胞毒素及免疫抑制性質(zhì)，因此，對人類及動物的健康構(gòu)成了威脅，特別是對免疫功能具有明顯的影響。根據(jù)DON的劑量和暴露時間不同可引起免疫抑制或免疫刺激。當人攝入了被DON污染的食物后，會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。由于中國傳統(tǒng)飲食習慣中糧谷比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害更為突出。1998年，在國際癌癥研究機構(gòu)公布的評價報告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物。歐盟要求嘔吐毒素要小于1.0mg/kg;中國谷物飼料中要求嘔吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg，飼料中低于5 mg/kg。

　　目前，國標法測定嘔吐毒素需要大型的儀器設(shè)備，價格昂貴，操作過程復(fù)雜、時間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)小型實驗室使用。除此之外，也有采用嘔吐毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡便快速，又能準確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實測，驗證了南京微測生物開發(fā)的嘔吐毒素熒光定量快速檢測試紙條的技術(shù)性能。

　　1實驗材料和方法

　　1.1試劑和材料

　　除注明外，均為分析純，試驗用水均為UP水。

　　熒光熒光定量檢測試紙條(由包被有熒光微球標記嘔吐毒素抗體的乳膠墊、噴涂有嘔吐毒素抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成)、樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均由南京微測生物科技有限公司提供。

　　嘔吐毒素及其他真菌毒素的標準品：購自Sigma公司;

　　大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。

　　麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

　　1.2儀器與設(shè)備

　　FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，南京微測生物科技有限公司提供;低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司;漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電子天平：Sartorius;

　　1.3試驗方法

　　1.3.1樣品的前處理

　　取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min)后，4000RPM離心1min，取上清。

　　1.3.2檢測過程

　　取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于5000μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結(jié)果。

　　2檢測結(jié)果分析

　　2.1線性范圍與檢出限

　　取7個無污染(陰性)小麥樣品和7個無污染(陰性)玉米樣品，分別添加100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg、2500μg/kg、5000μg/kg 的嘔吐毒素標準品，用上海飛測生物嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標，以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標，擬合曲線并計算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：

　　圖1 小麥中嘔吐毒素標準品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系

　　圖2 玉米中嘔吐毒素標準品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系

　　計算得出小麥的線性范圍：100～5000μg/kg(6點)， 回歸方程: y = 0.981x + 60.52，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997;玉米的線性范圍：100～5000μg/kg(6點)， 回歸方程: y = 0.976x + 52.00，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998;(見圖1和圖2)。

　　取10個無污染(陰性)小麥樣品和10個無污染(陰性)玉米樣品，用上海飛測生物嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，檢測限(LOD)為測定平均值加3倍標準偏差，定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標準偏差。測試結(jié)果表明，DON的LOD為25μg/kg，LOQ為82μg/kg。

　　2.2準確性和重復(fù)性分析

　　在用國標法測定為0的空白樣品中分別添加嘔吐毒素總量為100，250，500，1000，2000，5000μg/kg，然后按照嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條的檢測方法進行檢測。檢測結(jié)果見表1。

表1  不同樣本檢測的準確性和重復(fù)性

　　從表1可以看出，南京微測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中嘔吐毒素的添加回收率在83.51%~113.84%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.75%以內(nèi)。

　　2.3與色譜方法的對比試驗結(jié)果

　　大米、小麥、玉米、面粉、麩皮、噴漿玉米、大豆、豆粕各1份共24個樣本，先采用國標液相色譜法進行測定，再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條進行測定，各測試3個平行樣。檢測結(jié)果如下：

表2  與液相色譜法結(jié)果比對（μg/kg）

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，南京微測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為102.00%~110.85%，3次重復(fù)測定的的CV值在8.84%以內(nèi)。

      2.4方法特異性

選擇 DON結(jié)構(gòu)類似物和其他5種真菌毒素的標準品在陰性玉米中進行添加，添加的濃度為1000 μg/kg，然后用飛測生物嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條進行測試，每個樣品測3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，黃曲霉毒素B1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均＜5%，與其代謝物、結(jié)構(gòu)類似物有一定的交叉反應(yīng)（＜20%）。實驗結(jié)果表明，嘔吐毒素膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以能滿足檢測要求。

表3 交叉反應(yīng)率表

　　3結(jié)論

　　本實驗采用南京微測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試，該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg，最低定量限為82μg/kg，線性范圍為100-5000μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%，同一個樣本的檢測3個樣本的CV<14.75%，與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%，與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。其準確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對嘔吐毒素的分析標準的技術(shù)要求。該方法具有簡便快速、準確可靠、重復(fù)性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中嘔吐毒素的快速定量檢測分析。